RT-PCR技术操作流程

RT-PCR技术操作流程

RT-PCR是利用反转录酶催化dNTPs聚合成与mRNA模板互补的单链DNA(即cDNA)，以cDNA为模板在PCR反应系统中进行扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳法检测RT-PCR产物，从而间接检测mRNA的方法。

DEPC处理水溶解RNA，-20℃保存，备反转录之用。

(1) 按下列组成调制反应液：

样品总RNA 1μg

随机引物或oligo­-dT(18-20) 100pmol

脱氧核苷三磷酸(每种dNTP各l0mmol／L) 1μl

反转录缓冲液(5×) 4μl

RNase 抑制剂 (20~40U／μl ) 1μl

M-MLV 反转录酶 20U

DEPC处理水 补至20μl

阴性对照用DEPC处理水代替RNA模板，其余成分相同。将上述反应成分加于0.5ml EP管中，混匀，短时离心。

(2) 将各反应管放入PCR扩增仪上，37℃ 60min，70℃变性15min。反转录产物于4℃保存备用。

(1)按下列组成调制反应液：

Taq DNA聚合酶 1.0U

cDNA模板 1.0μl

引物一对(各10pmol／μl) 1.0μl

脱氧核苷三磷酸(每种dNTP各2.5mmol／L) 2.0μl

PCR缓冲液(10×，含MgCl2) 2.5μl

双蒸水 补至25.0μl

以反转录阴性对照取代cDNA模板作为PCR阴性对照，将上述反应成分加于0.2ml PCR管中，短暂离心，混匀。

(2) 将各PCR反应管放入DNA扩增仪，94℃5min，然后按以下条件进行热循环：94℃ 45s、56℃30s、72℃30s，循环30次，最后72℃延伸10min。

取PCR产物8μl 与 上样缓冲液2μl混合上样，适当大小的DNA Marker 一起电泳分离，溴乙锭染色，图像分析仪摄像并分析结果。

1．1％琼脂糖凝胶电泳记录结果。与DNA Marker相比，观察被检样品管的扩增产物位置，如与预期大小一致，且空白对照管中无扩增条带，说明本实验获得的条带与预期靶片段大小相符。

2．此方法的优点是可以由少量的mRNA(从1～2个哺乳动物细胞提取的mRNA)构成cDNA文库，RT-PCR可使所需模板的mRNA量大大减少。因此，对于低丰度mRNA的cDNA克隆及cDNA文库的构建非常有利。